Герб
 
 
Медицинская академия имени С.И. Георгиевского         
ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского»
Студенческая горячая линия по COVID-19
 

 

 
Версия для слабовидящих
 
Главная | Научная работа | Центральная научно-исследовательская лаборатория | Центр коллективного пользования научным оборудованием | Направление научных исследований | ИФА, ПЛЦ и ПЦР - использование при проведении исследований

ИФА, ПЛЦ и ПЦР - использование при проведении исследований


Центр коллективного пользования научным оборудованием «Молекулярная биология» имеет все необходимое оборудование и персонал для проведения лабораторной части медико-биологических исследований с использованием методов твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), проточной лазерной цитофлуориметрии (ПЛЦ) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-time ПЦР). 

Ниже в краткой форме приведены основные аналитические возможности этих методов и некоторые перспективы их применения при проведении исследований как сотрудниками КФУ, так и сторонними научными структурами и организациями, испытывающими потребность в проведении лабораторных исследований с привлечением указанных выше методов.

 

Иммуноферментный анализ (ИФА)

ЦКП укомплектован анализатором иммулогическим Multiskan FC, промывателем микропланшетным W600, термошейкером для инкубации планшетов PST-60HL, а также всем необходимым вспомогательным оборудованием. Все это позволяет использовать при выполнении научных исследований широкий спектр коммерчески доступных тест-систем, предназначенных для проведения ИФА.

ИФА базируется на использовании высокоспецифических взаимодействий в системе {антиген-антитело}, что позволяет идентифицировать и количественно определять самые разнообразные целевые аналиты. Поскольку реакция проводится непосредственно с использованием биологической жидкости, дополнительное применение методов выделения и очистки определяемых аналитов в большинстве случаев не требуется. Кроме того, с помощью ИФА можно одновременно анализировать большое число проб, что является удобным для целей экспресс-анализа. В связи с этим ИФА находит широкое применение в здравоохранении, различных областях сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной деятельности и научно-исследовательской работе.

Многие заболевания человека и животных можно быстро и надежно диагностировать путем идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при различных патологических процессах (онкологические, сердечно-сосудистые, эндокринные и другие заболевания). Количественное определение с помощью ИФА молекулярных структур, появление которых ассоциировано с развитием патологического процесса, с успехом используется для оценки эффективности применяемого лечения и прогноза клинического течения и исхода болезни. 

На сегодняшний день разработано и коммерчески доступно огромное количество тест-систем для ИФА, номенклатура которых может удовлетворить большинство запросов, возникающих при выполнении медико-биологических исследований. Кроме полностью готовых к употреблению тест-систем, многие биотехнологические компании производят отдельные компоненты, комбинирование которых позволяет конструировать иммуноферментные тест-системы для решения более узких и конкретных задач в рамках проводимой работы.

Диспансеризация населения; эпидемиологические обследования: диагностика инфекционных заболеваний; диагностика иммунных нарушений (аллергические и аутоиммунные процессы) и онкодиагностика; обнаружение токсикантов и наркотиков в крови; определение содержания лекарственных соединений в крови и тканях; оценка эффективности проводимого лечения при инфекционных и неинфекционных заболеваниях; трансплантология и акушерская патология; выявление вирусных заболеваний растений и сельскохозяйственных животных; определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений при отборе активных штаммов-продуцентов в промышленной биотехнологии; контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови на отсутствие ВИЧ и гепатита В – это лишь очень ограниченный перечень практического применения ИФА.
 

Проточная лазерная цитофлуориметрия (ПЛЦ)

ЦКП укомплектован проточным лазерным цитофлуориметром PAS-III, а также необходимым вспомогательным оборудованием. Все это позволяет использовать широкий спектр коммерчески доступных тест-систем для ПЛЦ.

ПЛЦ относится к числу высокоинформативных и современных многопрофильных технологий, используемых при проведении медико-биологических исследований. Метод ПЛЦ основан на измерении оптических характеристик индивидуальных клеток, которые по отдельности движутся в ламинарном потоке в проточной кварцевой кювете и пересекают сфокусированный специальной оптикой световой пучок, не касаясь стенок этой кюветы. Источником света могут быть различные типы лазеров, ультрафиолетовая лампа или же их комбинация. Проходя через измерительную кювету, клетки рассеивают свет в различных направлениях. 

Кроме того, свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцентных зондов, которые в результате предварительной обработки селективно связываются с различными клеточными компонентами. При этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных флуорохромов, что позволяет одновременно оценивать несколько изучаемых параметров. Световые сигналы преобразуются в электрические импульсы фотоэлектронными умножителями, оцифровываются и затем обрабатываются специализированным программным обеспечением. Получаемые результаты записываются в файл специального формата, а также отображаются в графическом виде на встроенном дисплее цитофлуориметра.

Цитофлуориметр PAS-III позволяет одновременно измерять несколько различных параметров: переднее светорассеяние под малыми (до 10 °С) углами (Forward-Scattered Lіght, FSC), боковое светорассеяние под углом 90 °С (Sіdе-Scattered Lіght, SSC], а также интенсивность флуоресценции при 3 разных длинах волн. Анализ FSC и SSC позволяет дифференцировать различные клеточные субпопуляции по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы, тогда как применение специфических флуоресцентных зондов дает возможность исследовать как экспрессию различных мембранных структур, так и характеризовать функциональное состояние изучаемых клеток.

На сегодняшний день с помощью ПЛЦ можно проводить иммунофенотипирование клеток крови (анализ субпопуляционного состава лимфоцитов и дифференциальная диагностика гемобластозов); определение содержания гемопоэтических стволовых клеток (CD34+) при трансплантациях костного мозга; анализ плоидности ДНК и исследование клеточного цикла; изучение внутриклеточного синтеза цитокинов и других регуляторных молекул; анализ пролиферативного статуса опухолевых клеток; исследование механизмов апоптоза и многое другое. 

Новые приложения ПЦЛ, основанные на принципах многоцветного анализа, включают в себя определение антиген-специфических клеток с использованием технологии тетрамеров, регистрацию внутриклеточного рН; оценку фагоцитарной активности и продукции активированными моноцитами и нейтрофильными гранулоцитами активных форм кислорода; определение в системе in vitro чувствительности пациентов к аллергенам и лекарственным препаратам.

Одним из практически важных направлений применения ПЛЦ могут быть исследования, связанные с терапевтическим применением полипотентных стволовых клеток. Мембранный антиген CD34 является специфичным маркером полипотентных кроветворных стволовых клеток, в связи с чем подсчет абсолютного числа CD34+-клеток в клеточных суспензиях с помощью ПЛЦ рассматривается в качестве “золотого стандарта” при оценке их количества в клеточных суспензиях.

 
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real-time ПЦР)

ЦКП укомплектован термоциклером CFX96 Touch Real Time, шкафами ламинарными 2-го класса биологической защиты SafeFAST Elite 212S, а также вспомогательным оборудованием, необходимым для проведения исследований с помощью Real-time ПЦР.

С помощью ПЦР возможно успешное решение следующих вопросов:

  • определение наличия специфических фрагментов генома. Применяется при выявлении генов, характерных для определения межвидовых различий (присутствия инфекционных возбудителей бактериальной и вирусной природы, при горизонтальном переносе генов, выявление генно-модифицированных организмов и т.д.);
  • определение структурных особенностей (мутаций) исследуемых фрагментов генома – вставки, делеции, точечные мутации (SNP-полиморфизм, single nucleotide polymorphism). Применяется для выявления вариантов нуклеотидной последовательности конкретного гена у данного организма. Используется для диагностики мутаций при моногенных заболеваниях, определения влияния мутаций в возникновении предрасположенности при мультифакториальных заболеваниях, влияния мутаций на особенности метаболизма, что отражается на вероятности развития патологического процесса, в том числе исследование структурных особенностей онкогенов и антионкогенов, факторов пролиферации, ферментов фармакодинамики и др.; 
  • определение активности конкретных генов по уповню их экспрессии. Подход основан на выделении суммарной РНК, ревертазном синтезе клональной ДНК и количественном сравнении продукта данного гена с продуктом одного из генов “домашнего хозяйства”. Возможно определение активности конкретного гена и его роли в процессах пролиферации и дифференцировки клеток, эмбриогенезе, малигнизации, развитии воспалительных процессов и т.д. Сопоставление структурных особенностей и активности генов представляется особенно важным для установления их патогенетического вклада в развитие патологии. 
 

Следует особо подчеркнуть, что для проведения исследований на базе ЦКП, кроме четкого осознания цели и задач планируемого исследования со стороны заказчика, необходимо наличие соответствующих наборов реагентов. Приобретение таких наборов реагентов, либо формирование заказа на их изготовление должно проводиться только после предварительного тщательного планирования дизайна лабораторных исследований с непосредственным участием сотрудников ЦКП.

 
up
©2006-2018 Разработка и сопровождение – информационно-аналитический отдел.
При использовании материалов ссылка на источник обязательна.
Design by SOFTSOUL.